Con la fine della dinastia della famiglia dei Medici, avvenuta nel 1737, dopo la morte di Gian Gastone Medici, si aprì un grosso problema sulla fine delle collezioni degli Uffizi. Oculatamente, Anna Maria Ludovica, la sorella di Gian Gastone, stipulò una convenzione con la dinastia dei Lorena. Si impegnava a cedere tutte le collezioni ai Lorena, con la clausola che le opere rimanessero a Firenze, inalienabili, escludendo così i pericoli di frazionamento e dispersione in altri luoghi. Il patto fu rispettato dai Lorena, tanto che oggi possiamo ammirare la Galleria degli Uffizi con tutte le sue opere d’arte. Purtroppo non avvenne altrettanto per le collezioni di Mantova e di Urbino.

Superato l’incendio, del 1762, che distrusse il corridoio orientale, anche se soltanto in parte, nel 1769, la Galleria fu aperta al pubblico, grazie a Pietro Leopoldo di Lorena. Per questo motivo, venne attivato un nuovo ingresso, ideato dall’architetto Zanobi del Rosso, e la direzione degli Uffizi fu affidata a Giuseppe Pelli Bencivenni. La nuova situazione comportò anche un ripensamento generale di tutte le collezioni del museo e delle loro esposizioni. Ripensamento che fu affidato all’illuminista Luigi Lanzi, che riorganizzò le esposizioni seguendo un principio razionalistico e pedagogico. Per razionalità, il Lanzi fece rimuovere dal museo l’armeria, traslò la collezione degli strumenti scientifici nella Specola e vendette la raccolta di maioliche. Tutto questo per concentrare la Galleria sulle opere d’arte. Le arti minori vennero, però, sottovalutate.

Nel 1779, giunse da Villa Medici a Roma, Niobe e i suoi figli. L’opera, insieme ad altre sculture antiche, fu inserita nell’omonima Sala della Niobe, realizzata da Gaspare Maria Paletti. Nel 1793, fu eseguito uno scambio tra gli Uffizi e la Galleria Imperiale di Vienna. Alcune produzioni fiorentine appartenenti ai secoli XVI e XVII, lasciarono l’Italia. Tra queste i lavori di  Fra Bartolomeo. In compenso arrivarono a Firenze quadri di Tiziano, Giovanni Bellini, Giorgione e Dürer.

Le 28 statue di marmo presenti nelle nicchie dei pilastri esterni, che raffigurano persone toscane importanti, che vanno dal Medioevo all’Ottocento, furono inserite nella prima metà del XIX secolo. Con l’Unità d’Italia ed il trasferimento della capitale a Firenze, il Senato si riunì più volte proprio nel Teatro mediceo degli Uffizi (tra i senatori anche il Manzoni). Il Teatro fu eliminato nel 1889. Alla fine dell’Ottocento, alcune opere lasciarono la Galleria a favore del Museo del Bargello (statue rinascimentali) e del Museo Archeologico (statue etrusche). Con una ristrutturazione di Mariano Falcini, nel 1866 trovarono sede nel palazzo le Regie Poste. Oggi l’area è utilizzata per delle esposizioni a rotazione di materiale dei depositi.

All’inizio del 1900, si iniziarono ad acquistare opere da istituti religiosi, come il Trittico Portinari (dalla chiesa di Sant’Egidio) e la quadreria appartenente all’arcispedale di Santa Maria Nuova, L’area dei due piani ricavati dalla soppressione del Teatro mediceo, fu oggetto, nel 1956, di restauri ed allestimento da parte di illustri architetti del calibro di Giovanni Michelucci, Carlo Scarpa, Ignazio Gardella. Nel 1969 è stata acquistata la Collezione Contini Bonacossi.

Con lo spostamento dell’Archivio di Stato, il primo piano è tornato a disposizione della Galleria. Oggi è occupato dall’esposizione di opere del Seicento (anche con dipinti di Caravaggio), e da mostre temporanee di grande richiamo.

A metà del 1572, pur non essendo terminata la costruzione, si trasferirono nel palazzo degli Uffizi tutte le magistrature dalla parte di San Pier Scheraggio. Con la successione di Francesco I, tuttavia l’edificazione passò nelle mani di Bernardo Buontalenti, coadiuvato da Alfonso Parigi il vecchio. La fabbrica fu ultimata nel 1580. In questi anni, si iniziò anche il lavoro negli interni. Si affrescarono a “grottesca” le volte della Galleria, dipinte da Antonio Tempesta e poi da Alessandro Allori.  L’anno seguente l’ultimazione dei lavori, il duca Francesco, decise di riservarsi la loggia superiore, ospitandovi la collezione di famiglia, in particolare, quattrocentesca. La preziosa raccolta comprendeva dipinti (ed anche ritratti della famiglia Medici), statue antiche e moderne, ma pure oreficerie, cammei, medaglie, bronzetti, armature, miniature, strumenti scientifici e rarità naturalistiche.

Quella dei Medici è la prima raccolta ospitata dalla Galleria degli Uffizi, e ne costituisce il nucleo fondativo. Nel 1583, il duca fece trasformare il terrazzo sopra la loggia, in un giardino pensile, dove si intratteneva la sua corte. Con il tempo, il giardino è scomparso. Bernardo Buontalenti realizzò, su indicazione del duca, alcuni elementi speciali. Dopo la Tribuna nella loggia, nel 1586, costruì un vero e proprio teatro all’interno del palazzo. Fu pensato a doppia altezza, posto tra il primo e il secondo piano, presentava gradinate sui tre lati di un grande rettangolo. Nella parte centrale era collocato il palco dei principi. Nell’Ottocento il grande vano venne ridiviso in due piani: sopra attualmente sono situate delle sale espositive, mentre nel piano inferiore è ospitato il Gabinetto Disegni e Stampe. Della costruzione rimane il vestibolo e il portale d’ingresso (al teatro), oggi al Gabinetto Disegni.

Il duca Ferdinando I de’ Medici, nel 1587, fece chiudere un terrazzo vicino alla tribuna, ricavandone la sala chiamata “delle carte geografiche“, con affreschi di Ludovico Buti. Nella sala si dispose la “Serie Gioviana“, una collezione che comprendeva i ritratti di uomini importanti, raccolta da Paolo Giovio, vescovo di Como. Sempre Ferdinando I, oltre a far giungere agli Uffizi la sua la collezione di armi e armature, vi fece trasferire nel 1588 l’Opificio delle Pietre Dure, una manifattura di Stato, e, costruendo, nell’ala di ponente del palazzo, lo scalone (oggi detto del Buontalenti), accolse laboratori di scultori e pittori, ma anche di orafi, gioiellieri, miniatori, giardinieri e ceramisti di preziose porcellane. Nel 1591, fu aperta la visita alle collezioni, da effettuarsi su richiesta.

Dopo una cinquantina d’anni, alla morte di Ferdinando I, la Galleria risultava inalterata. Verso la metà del Seicento, Vittoria della Rovere, andata in sposa a Ferdinando II de’ Medici, portò in dote la splendida collezione dei Rovere di Urbino, che comprendeva opere del Tiziano, Piero della Francesca, Raffaello, Federico Barocci e molti altri artisti. Dal cardinale Leopoldo de’ Medici, inoltre, si accluse una collezione di quadri di scuola veneta, e ulteriori disegni e miniature, ma anche autoritratti.

Sotto il Granducato di Cosimo III de’ Medici, tra il 1696 e il 1699, fu ampliato il braccio di ponente della Galleria e decorato quello sull’Arno, con raffinati stucchi di Giuseppe Nicola Nasini e Giuseppe Tonelli. Cosimo III, che intanto raccoglieva rarità e stramberie naturalistiche (come voleva la moda dell’epoca), comprò una serie di quadri di scuola fiamminga, tra cui alcuni Rubens. Sempre dal mercato acquisì alcune statue romane, tra cui la celebre Venere Medici, che risultò un rarissimo originale d’epoca greca. La Venere è divenuta in seguito un’icona del museo degli Uffizi.